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                    《科學24小時》

                    開博時間:2016-07-01 14:43:00

                    旨在向全國廣大群眾,特別是具有中等文化程度的廣大青年,普及科學技術知識,繁榮科普創作,啟迪思想,開拓視野。

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                    劃時代的冷凍電鏡技術

                    2018-06-03 23:12:00

                      2017年10月4日,2017年度諾貝爾化學獎授予了英國分子生物學家及生物物理學家理查德·亨德森、美國哥倫比亞大學德裔生物物理學家約阿基姆·弗蘭克以及瑞士洛桑大學生物物理學家雅克·迪波什。獲獎理由是“開發出冷凍電子顯微鏡技術(也稱為低溫電子顯微鏡技術)用于確定溶液中的生物分子的高分辨率結構”,簡化了生物細胞的成像過程,提高了成像質量。

                      迪波什 在真空環境下使生物分子保持自然形狀

                      現年75歲的雅克·迪波什出生于瑞士,他的重要貢獻是在真空環境下使生物分子保持自然形狀。大致于1978年,迪波什開始解決電子顯微鏡領域的樣品干涸并遭破壞的問題。如前所述,亨德森在細菌視紫紅質成像上曾用葡萄糖來保護樣品,但這種方法并不普遍適用。

                      迪波什得出的方法是對生物樣品進行玻璃化。一般情況下,通過氫鍵的相互作用,水分子會在凝固過程中有序排列,形成晶體。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就讓其凝固,方法是將生物樣品浸入事先經液氮冷卻的乙烷中,這樣就能使水在數毫秒之內完全凝固。這種方法得到的就不是晶體而是無定形態,而玻璃也是處于無定形態,玻璃化名稱由此而來。生物樣品嵌在無定形冰中,堪稱留下了真實的一瞬間。1982年,迪波什開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術制作的不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品。1984年,迪波什首次發布不同病毒的結構圖像。隨著冷臺技術的開發,冷凍電鏡技術正式推廣開來。

                      亨德森 選擇高分辨率觀察生物大分子

                      現年72歲的理查德·亨德森出生于蘇格蘭,現為劍橋大學醫學研究理事會MRC分子生物學實驗室主任,發起了一場高分辨率觀察生物大分子的革命。1975年,電子顯微鏡誕生40年之際,因亨德森在細菌視紫紅質上的嘗試,證明了電子顯微鏡在生物領域的適用性。他將未脫離細胞膜的細菌視紫紅質直接放置在電子顯微鏡下進行觀察,借助表面覆蓋的葡萄糖防止真空干涸,并采用強度更低的電子束流,觀察到細菌視紫紅質在細胞膜上規整排列且朝向一致。

                      之后,亨德森和同事獲得了細菌視紫紅質較為粗糙的三維立體結構圖像,這也是歷史上第一張膜蛋白領域的三維結構圖像。1990年,亨德森又成功地使用電子顯微鏡顯示蛋白質的三維圖像,達到原子級分辨率。這一突破性成果證明了用電子顯微鏡進行生物分子成像的潛力。

                      弗蘭克 冷凍電鏡單顆粒分析的鼻祖

                      現年77歲的德裔生物物理學家約阿基姆·弗蘭克,最大的貢獻是讓冷凍電鏡技術變得具有普遍應用價值。弗蘭克在1981年完成了一種算法,利用計算機識別圖像把相同蛋白質的不同影子收集起來,并且將輪廓相似的圖像進行分類對比,通過分析不同的重復模式將圖片擬合成更加清晰的2D圖像。在此基礎上,通過數學方法,在同一種蛋白質的不同2D圖像之間建立聯系,以此為基礎擬合出3D結構圖像,他的圖形擬合程序被認為是冷凍電鏡發展的基礎。此外,他對細菌和真核生物的核糖體結構和功能的研究也做出重要貢獻。核酸和蛋白質是生命活動的關鍵密碼,核酸攜帶遺傳物質,備受科學家關注,蛋白質是生命活動的主要執行者。人們對蛋白質結構的解析始于20世紀60年代。結構生物學領域有一條不成文的觀點:結構決定功能。只有知道生物分子的原子排布,科學家們才能了解這個蛋白的功能。蛋白質結構解析的常用實驗方法有兩種:X射線衍射晶體學成像和核磁共振成像。

                      作為最早用于結構解析的實驗方法之一,X射線衍射晶體學成像運用了幾十年。X射線是一種高能短波長的電磁波(本質上屬于光子束),被德國科學家倫琴發現,故又被稱為倫琴射線。理論和實驗都證明了,當X射線打擊在分子晶體顆粒上的時候,X射線會發生衍射效應,通過探測器收集這些衍射信號,可以了解晶體中電子密度的分布,再據此獲得粒子的位置信息。由于X射線對晶體樣本有著很大的損傷,因此常用低溫液氮環境來保護生物大分子晶體,但是這種情況下的晶體周圍環境非常惡劣,可能會對晶體產生不良影響。而且X射線衍射方法不能用來解析較大的蛋白質。

                      核磁共振成像的基本理論是,帶有孤對電子的原子核(自選量子數為1)在外界磁場影響下,會導致原子核的能級發生塞曼分裂,吸收并釋放電磁輻射,即產生共振頻譜。這種共振電磁輻射的頻率與所處磁場強度成一定比例。利用這種特性,通過分析特定原子釋放的電磁輻射結合外加磁場,可以用于生物大分子的成像或者其他領域的成像。核磁共振結構解析多是在溶液狀態下的蛋白質結構,一般認為比起晶體結構更能夠描述生物大分子在細胞內的真實結構,而且能夠獲得氫原子的結構位置。然而核磁共振也并非萬能,有時候也會因為蛋白質在溶液中結構不穩定難以獲取穩定的信號,因此,往往需要借助計算機建?;蛘咂渌椒▉硗晟平Y構解析流程。

                      但事實上,以上兩種常用的傳統手段都不能讓研究者獲得高分辨率的大型蛋白復合體結構,致使生物結構學領域的發展受困于成像技術。2013年,冷凍電鏡技術出現突破:不需要結晶且需要樣品量極少,即可迅速解析大型蛋白復合體原子分辨率的三維結構。電子直接探測相機和三維重構軟件兩項關鍵技術在結構生物學領域產生重大影響,傳統X射線、傳統晶體學長期無法解決的許多重要大型復合體及膜蛋白的原子分辨率結構,一個個被迅速解決,并紛紛強勢占領頂級期刊和各大媒體版面。研究人員通過對運動中的生物分子進行冷凍,即可在原子層面上進行高分辨成像,無需將大分子樣品制成晶體。隨后這項技術應用也正式迎來井噴式發展階段。2015年,國際著名期刊《自然》旗下子刊《自然方法》將冷凍電鏡技術評為年度最受關注的技術。

                      引領這些技術突破的背后離不開亨德森、弗蘭克和迪波什三位冷凍電鏡領域的開拓者分別在基本理論、重構算法和實驗方面的早期重要貢獻。諾貝爾獎官方表示:“三人的貢獻令生物分子的成像變得更簡單和清晰,讓生物化學進入了一個新時代。我們可能很快就能在原子分辨率上獲得復雜的生命裝置的精細圖像?!鄙踔劣忻襟w稱:“冷凍電鏡是可與測序技術、質譜技術相提并論的第三大技術?!?/font>

                      冷凍電鏡技術,指的是應用冷凍固定術,在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術,能將生物分子“凍起來”,讓人們前所未有地觀察分析其運動過程,對于生命化學的理解和藥物學的發展都有決定性影響。具體操作時,先將樣品冷凍起來,然后在低溫狀態下放進顯微鏡,讓高度相干的電子作為光源從上面照下來,透過樣品和附近的冰層,造成散射。再利用探測器和投射系統把散射信號成像記錄下來,最后進行信號處理,得到樣品結構。

                      這項用于掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品,如生物、高分子材料等。樣品經過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣(噴金/噴碳)等處理后,通過冷凍傳輸系統放入電鏡內的冷臺(溫度可至-185℃)即可進行觀察。其中,快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態,減少冰晶的產生,從而不影響樣品本身結構,冷凍傳輸系統保證研究人員在低溫狀態下對樣品進行電鏡觀察。將電子顯微鏡和計算機建模成像結合在一起的大量實踐,是在新世紀之后開始流行的。冷凍電鏡時代的真正來臨,還得益于樣品制備技術、新一代電子探測器發明、軟件算法優化等多方面技術的進步,更多的信息和更低的噪音保證了高分辨率的圖像。

                      科學家希望能制造出更靈敏的電子探測器,以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話,就能夠對更小的、更動態的分子進行成像,并且分辨率更高。在大數據時代的基因組、蛋白質組、代謝組、脂類組等飛速發展的今天,蛋白質結構組理應得到更加廣泛的重視,針對蛋白質的藥物篩選和計算機輔助的藥物研究不應被低估。發展高精度、高效的結構解析技術有著重要意義,可以預見未來在蛋白質結構領域有著更多的驚喜。

                    本文來自《科學24小時》

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