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                    《張江科技評論》

                    開博時間:2019-06-06 14:03:00

                    《張江科技評論》是由上??茖W技術出版社與上海市張江高科技園區管理委員聯合創辦的一本科技評論類雜志。該刊報道評價國內外創新性科學技術的發展趨勢及其商業價值,介紹上海在建設全球領先科創中心進程中的制度成果、技術成果、創業成果,推動產學研密切協作,促進科技成果轉化,服務經濟轉型發展。

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                    斬獲諾貝爾獎:重寫生命的基因剪刀

                    2021-02-02 16:17:00

                      CRISPR/Cas9基因編輯技術自誕生以來迅速發展,目前已經成為生命科學、醫學等領域最耀眼、最有前景的技術之一。2020年諾貝爾化學獎授予CRISPR/Cas9技術無疑將再次掀起一場生物技術革命。


                      北京時間2020年10月7日下午5時48分,瑞典皇家科學院宣布,2020年諾貝爾化學獎授予第三代基因編輯技術——CRISPR/Cas9系統的發現者,德國馬克思?普朗克生物感染研究所的科學家埃馬紐埃爾?沙爾龐捷(Emmanuelle Charpentier)和美國加利福尼亞大學伯克利分校的科學家珍妮弗?杜德納(Jennifer Doudna)。她們的研究成果被譽為掀起一場生物技術的革命。此前,憑借開發出基因編輯工具CRISPR/Cas9,兩位杰出的女性科學家已經共享了2015年度生命科學突破獎、2015年度遺傳學格魯伯獎、2016年度加拿大加德納國際獎(與張鋒共享)和2020年度被譽為諾貝爾獎風向標的沃爾夫醫學獎。


                      CRISPR/Cas9系統的發現之路

                      沙爾龐捷,1968年生于法國尤維斯,1995年博士畢業于法國巴黎巴斯德研究所,2002年開始建立獨立研究組,主要研究人類感染相關的病原微生物——化膿性鏈球菌。研究過程中沙爾龐捷注意到細菌中存在許多小RNA分子,其序列與諸多真細菌(Bacteria)和古細菌(Archaea)基因組中包含的重復性核苷酸類似。多年來,沙爾龐捷一直致力于研究這些小RNA分子如何調控細菌的生理過程,她發現這些小RNA分子(CRISPR RNA和tracrRNA)與一種稱為Cas9核酸酶的DNA切割酶相互作用能夠定向切斷細菌的基因組DNA,相關研究成果于2011年發表在《自然》(Nature)雜志上。

                      杜德納,1964年生于美國華盛頓特區,1989年博士畢業于美國波士頓哈佛醫學院,2002年進入美國加利福尼亞大學伯克利分校,一直從事RNA分子研究。得益于杜德納求學階段的廣泛涉獵,2005年她從地球和行星科學教授吉莉恩?班菲爾德(Jillian Banfield)處獲知,進化關系差異極大的多種細菌和古細菌的基因組DNA中包含大量相同的重復序列,序列中間有部分區段與病毒相似。于是,科學家推測這是簡單單細胞生物細菌和古細菌的“免疫系統”,也就是說,這些細菌當受到細菌性病毒感染后,會將來自病毒的部分序列整合到自身基因組中,以抵御病毒的再次入侵。不過,最初科學家以為這些片段與RNA干擾相關。杜德納則另辟蹊徑,發現了細菌基因組中另一群編碼與DNA切割蛋白同源的基因Cas,并證實其具有切割細菌DNA及病毒DNA的能力。

                      2011年,沙爾龐捷和杜德納開始合作研究CRISPR系統,純化出Cas9核酸酶,并證實了CRISPR/Cas9系統的工作方式:作為細菌免疫系統的一部分,CRISPR系統能產生攜帶病毒遺傳信息的RNA序列,該RNA序列可以引導Cas9核酸酶在細菌DNA分子上找到入侵的病毒DNA序列,并經tracrRNA介導切割目的區域的DNA序列。該研究成果于2012年發表在《科學》(Science)雜志上。CRISPR/Cas9系統在細菌應對病毒感染中行之有效,但真核生物的DNA雙鏈被切割后仍舊能被復雜的修復系統恢復,所以并不會被摧毀。不過,DNA雙鏈斷裂后的修復階段為科研人員對DNA進行加工和操作帶來了可能。據此,研究人員設計出第三代基因編輯技術,將guide RNA和tracrRNA相連組成單一的引導RNA,進一步簡化了CRISPR/Cas9系統。

                      事實上,CRISPR/Cas9系統并非首個被設計出來的基因編輯工具系統?;蚓庉嫃募夹g上來說是定點突變,是為了獲取目標性狀而精準和定向改變目標DNA的一門技術。如果說“物競天擇,適者生存”是大自然對隨機突變基因庫的定向選擇,那么,人類為了滿足自身需求對作物和牲畜的馴化和雜交也稱得上無意識的“廣義的基因編輯”。但是,這種策略獲得基因融合的過程往往需要多代雜交和長時間的選育。

                      近幾十年來生物學的迅猛發展給高效、精準的定點基因編輯帶來了可能。鋅指核酸酶ZFN(zinc finger nuclease)是第一代基因編輯工具,其主要功能結構包括1個核酸內切酶FokⅠ和用于識別DNA的鋅指蛋白。工作時,ZFN首先特異性地識別一段DNA序列,再由核酸內切酶FokⅠ切斷DNA。轉錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技術是第二代基因編輯技術。黃單胞菌自然分泌的蛋白TALEs能特異性識別不同的堿基對,而TALEN技術就是通過一串TALEs識別特異性DNA序列,再利用核酸內切酶FokⅠ進行準確切割。前兩代基因編輯技術有著共同的缺點,就是對DNA序列的識別依賴于蛋白質,難以應對復雜的特異性DNA序列,設計和操作相對困難,且效率不高。

                      CRISPR/Cas9系統創新性地使用RNA作為序列識別向導。由于RNA與DNA嚴格匹配,技術簡單且廉價,編輯高效、精準,CRISPR被稱為編輯基因的“魔剪”,已深入基礎研究的各個領域,并開始進入應用階段??梢灶A見,未來CRISPR/Cas9系統還將在更多領域給人類的生活帶來深遠的影響。

                      CRISPR的歷史和發展

                      實際上,CRISPR序列是1987年由日本Nakata研究組的分子生物學家石野良純(Yoshizumi Ishino)首次發現的。在其后的十多年間,多位科學家發現有20多個細菌和古細菌中都包含該序列。2002年,生物信息學分析發現這些序列僅存在于真細菌域和古細菌域中,在真核生物域和病毒中是不存在的。隨后,研究人員將其定名為CRISPR。同時,科學家還發現了這些區段周圍的幾個同源基因,并將其命名為Cas。直到2005年,3個研究組發現CRISPR中的間隔序列來自外來病毒,并證實病毒無法感染攜帶有與病毒同源序列的細胞,研究提示CRISPR參與細菌免疫。

                      2012年,沙爾龐捷和杜德納開創性地闡釋了CRISPR/Cas9系統的生化機理。2013年年初,美國哈佛大學醫學院的喬治?丘奇(George Church)、麻省理工學院博德研究所的張鋒、加利福尼亞大學舊金山分校的齊磊(Lei S. Qi)分別在《科學》(Science)和《細胞》(Cell)雜志上發表針對CRISPR/Cas9系統改造研究的論文,并成功地將CRISPR/Cas9系統運用到真核生物(哺乳動物)細胞中。其中,張鋒將Cas9改造成缺口酶,大大促進了產生的雙鏈斷裂處的DNA修復過程,成為后來定點突變的最通用體系。齊磊通過突變掉Cas9的核酸內切酶形成dCas9,通過改變向導RNA的靶向區域達到抑制或者激活轉錄的目的。之后的幾年內,針對CRISPR/Cas9系統的缺陷和局限性,如脫靶率高等問題,科學家仍在不斷改進。

                      丘奇和張鋒首創性地將CRISPR/Cas9系統應用在活體細胞中,且申請并獲得了專利。在巨大的應用前景前,CRISPR/Cas9系統的專利權大戰也隨之展開。2014年,張鋒獲得了美國專利商標局(USPTO)批準的CRISPR基因編輯技術的專利申請;2020年9月10日,美國專利審查與上訴委員會(PTAB)發布稱,來自麻省理工學院博德研究所的張鋒團隊具有在真核細胞中使用CRISPR技術的專利優先權,但2位諾貝爾獎獲得者——沙爾龐捷和杜德納所帶領的德國馬克思?普朗克生物感染研究所和美國加利福尼亞大學伯克利分校的研究團隊在CRISPR的核心使用技術上也可能獲得專利權,暗示了CRISPR的專利權大戰仍未休止。當然,關于諾貝爾獎歸屬問題,在學術界同樣存在爭論。曾有學者認為,沙爾龐捷和杜德納的貢獻是在生物化學領域,應獲得諾貝爾化學獎,而諾貝爾生理學或醫學獎則應頒給喬治?丘奇和張鋒,以表彰他們在醫學應用上的貢獻。如今諾貝爾化學獎的確花落沙爾龐捷和杜德納,而本屆生理學或醫學獎并未授予CRISPR系統。

                      CRISPR/Cas9系統的前景和隱患

                      從CRISPR系統的發現到斬獲諾貝爾獎,CRISPR/Cas9系統僅僅走過了8年。事實上,CRISPR/Cas9系統也是最快走向應用的生物化學/醫學發現之一,在基礎研究層面極大地促進了基因功能研究。早在2013年5月,魯道夫?耶尼施(Rudolf Jaenisch)研究組就已經利用CRISPR/Cas系統制造了基因缺陷小鼠。但是,在2013年前要想制備一個基因編輯細胞還非常困難,需要一定的資金、大量的背景群體和較長的時間。隨著我國經濟、文化和科技的飛速發展,我國基礎醫學和生物學領域研究突飛猛進,在許多方面已經迎頭趕上甚至超越國外同行。2013年至2015年,張鋒的CRISPR/Cas9系統在我國實驗室的使用已經非常成熟,在細胞中定點敲除1個基因只需要1~2星期。2013年12月,中國科學院生物化學與細胞生物學研究所的李勁松研究員就已經將CRISPR/Cas9系統與顯微注射結合,實現從合子就開始突變的轉基因小鼠“量產”。截至目前,科研人員已經實現了對果蠅、線蟲、小鼠、大鼠、豬、羊、猴、水稻、小麥、高粱等多種生物的基因編輯。

                      與此同時,CRISPR在應用領域更是前途廣闊。在不受倫理困擾的農業、畜牧業領域,育種專家們利用CRISPR/Cas9系統定點編輯抗病等基因,實現了傳統方法難以匹敵的高效育種。在人類疾病研究模型鼠、模型猴身上,科學家利用CRISPR/Cas9系統治愈了白內障等疾病。2016年,首例利用CRISPR/Cas9系統治療人類疾病的臨床試驗在四川大學華西醫院開展,該臨床研究是利用CRISPR/Cas9系統使細胞中的關鍵性抑制因子PD1發生免疫,再將編輯過的免疫細胞進行體外培養擴增后重新回輸至腫瘤患者體內。然而,科技是把雙刃劍。2018年11月,南方科技大學副教授賀建奎利用CRISPR/Cas9系統編輯的人類胚胎出生,輿論一片嘩然,更引發國內外有關學術道德和醫學倫理的廣泛討論,“CRISPR/Cas9”“基因編輯”這些基礎研究領域的專有名詞也首次進入大眾視線。造福人類的同時必須規避濫用風險,CRISPR/Cas9系統這一強大工具更需要強有力的倫理監管。

                      牛寧寧,上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院副研究員。

                      文/牛寧寧

                    本文來自《張江科技評論》

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